Préparation in vitro du nerf phrénique – diaphragme du rat
Version française : J. Atkinson, Faculté de Pharmacie, UHP-Nancy1, France

In vivo et in vitro la démonstration des propriétés pharmacologiques des médicaments agissant sur le muscle squelettique via le système nerveux moteur peut être effectuée avec différentes préparations. Les préparations du nerf phrénique - diaphragme chez le rat, du rectus abdominis chez la grenouille et du biventor cervicis chez le poulet sont fréquemment utilisés in vitro. In vivo des préparations des muscles gastrocnemius, soleus antérieur ou tibialis  (stimulé via le nerf sciatique ou une de ses branches) sont utilisées. 
L’enregistrement de la contractilité au repos et de la réponse contractile provoquée par une simulation unique ou un tétanos peut être obtenu facilement avec la préparation nerf phrénique/diaphragme. La simulation de cette préparation sur ordinateur peut atteindre plusieurs objectifs d’enseignement normalement atteints par le travail de laboratoire. Ce programme est particulièrement adapté à l’enseignement de planification expérimentale.
Médicaments et procédures disponibles
La stimulation électrique peut être appliquée au nerf phrénique en utilisant des stimuli rectiliniens supramaximaux d’une durée de 0.2 msec et à une fréquence de 0.05 ou 0.5 Hz. Ce n’est qu’à cette dernière fréquence que peut être démontrée la capacité de la triéthylcholine d’inhiber la transmission par diminution du stockage de l’acetylcholine. De plus la stimulation électrique peut être arrêtée, par exemple dans le cas d’études des effets de l’acétylcholine. Une stimulation tétanique (30 Hz, supramaximal, 5 sec) peut être utilisée pour distinguer entre une inhibition compétitive (non dépolarisante), obtenue avec un tétanos peu soutenu, d’un blocage dépolarisant (qui résulte d’un tétanos de moindre amplitude mais mieux soutenu). Il est à noter que la stimulation tétanique est modifiée par des bloqueurs compétitifs (non dépolarisants) à des concentrations plus faibles que celles nécessaires pour modifier la réponse à des stimuli isolés.
De nombreux médicaments sont disponibles et les concentrations nécessaires pour obtenir une réponse franche mais  submaximale sont données dans le tableau 1. La concentration nécessaire sera influencée par la fréquence de stimulation, la présence d’autres substances, et le protocole expérimental utilisé.
Une substance inconnue (“ Unknown agent ”) est fournie par le programme et les étudiants ont pour exercice de la caractériser et de déterminer sa nature. La substance est un bloqueur neuromusculaire de type compétitif 
non dépolarisant ou de type polarisant. La puissance de la substance inconnue est fixée au hasard par l’ordinateur. Cette puissance est exprimée relativement à celle d’une substance de référence (tubocurarine ou suxaméthonium). A la fin de la session, les caractéristiques de la substance inconnue sont divulguées. Une fois cette information donnée, une nouvelle substance inconnue avec des caractéristiques différentes est choisie pour la séance suivante.
Utilisation du programme
La navigation se fait par des menus. Chaque expérience commence avec une fréquence de stimulation 0.05 Hz et des réponses contractiles provoquées sont montrées. Le déroulement des réponses contractiles continue jusqu’à ce que l’on clique sur le bouton “Click for drugs menu ”. Cette opération arrête l’expérience et le menu principal apparaît sur l’écran. En cliquant sur le bouton “ Continue experiment ” le déroulement des réponses contractiles se poursuit. Alternativement une procédure ou une substance peut être sélectionnée. Lors de chaque administration d’une substance, la concentration nécessaire doit être spécifiée par l’utilisateur. Une fois la substance ou la procédure sélectionnée, les réponses contractiles correspondantes commencent à défiler sur l’écran et continueront jusqu’à ce que l’on clique sur le bouton “Click for drugs menu ”. L’utilisateur contrôle ainsi l’expérience et peut déterminer les médicaments, leurs concentrations et l’ ordre à appliquér. L’utilisateur peut quitter le programme en utilisant le bouton “ Discard preparation ” à n’importe quel moment. En quittant avec “ Discard preparation and end experiment ”, les caractéristiques de la substance inconnue sont données. Alternativement, une nouvelle préparation peut être mise en route avec “ New preparation ; continue with experiment ”. Dans ce cas la substance inconnue restera la même et sa nature n’est pas révélée. Chaque substance peut être éliminée du bain avec l’option “ Washout bath ” quand nécessaire.
Il est possible que le bouton “Click for drugs menu ” soit inactivé par le programme surtout lors de la phase initiale qui suit l’administration d’une substance. Ceci empêche qu’une deuxième substance soit administrée à un moment inapproprié. Cette inactivation est particulièrement remarquée quand les substances avec une durée d’action très longue (telles que la triéthylcholine ou la choline) sont utilisées, surtout à la fréquence de stimulation la plus élevée (O,5Hz). L’expérience peut être terminée à n’importe quel moment en sélectionnant l’option “Discard preparation ”. Ensuite en cliquant sur “ New preparation ; continue with experiment ”, l’utilisateur continuera avec une nouvelle préparation (dans ce cas, la substance inconnue n’est pas divulguée et ses caractéristiques restent inchangées). La deuxième possibilité est de quitter le programme (“ Discard preparation and end experiment ”) dans ce cas, les propriétés de la substance inconnue sont données. Une fois les caractéristiques de la substance inconnue données, la substance inconnue changera à chaque nouvelle séance.
Le bouton “ Click to pause experiment or to review record ” provoque l’ arrêt de l’expérience et permet ainsi la réflexion quant à la substance ou la concentration suivante à utiliser. Cela permet à l’étudiant de revoir son enregistrement et d’imprimer les sections appropriées. Le programme doit être utilisé avec une imprimante reliée directement à l’ordinateur. L’utilisation d’une imprimante en réseau provoquera des problèmes d’attente.
Pharmacologie des substances    
Atropine : antagoniste compétitif des récepteurs cholinergiques et muscariniques        
Neostigmine, physostigmine, edrophonium : anticholinestérases                                       
Tubocurarine, pancuronium, atracurium, gallamine, fazadinium : bloqueurs compétitifs non dépolarisants de la jonction neuromusculaire. Il est à noter que l’atracurium est instable au pH de la solution de Krebs.                          
Suxaméthonium, decaméthonium : bloqueurs dépolarisants de la jonction neuromusculaire.
4-Aminopyridine : bloqueur des canaux potassiques. Cette action augmente la libération de l’acétylcholine, ce qui aura pour résultat une abolition d’un blocage compétitif partiel.
Triéthylcholine : inhibiteur du recaptage de la choline qui diminue la synthèse de l’acétylcholine et provoque à la longue un blocage de la transmission neuromusculaire (à condition que la fréquence de stimulation soit suffisamment élevée pour provoquer une diminution de la quantité d’acétylcholine stockée). A une plus forte concentration, la triéthylcholine bloque la transmission neuromusculaire par un mécanisme qui n’implique pas une diminution de la quantité d’acetylcholine stockée. Il est à noter que les effets de la triéthylcholine peuvent être annulés par la choline.
Dantrolène : cet agent produit un blocage de la transmission neuromusculaire de très longue durée. Cet effet n’est pas purement polarisant ou non dépolarisant.
Hexaméthonium : antagoniste de la transmission au niveau des récepteurs cholinergiques nicotiniques. Cette substance est plus efficace au niveau des récepteurs nicotiniques ganglionnaires.
Acétylcholine, carbachol: agonistes nicotiniques. A de très fortes concentrations, un blocage de type dépolarisant est obtenu.
Lignocaïne : anesthésique local qui bloque les canaux sodiques neuronaux.                            
Streptomycine : agent antibactérien qui bloque la transmission neuromusculaire.
Exercices
Les exercices suivants peuvent être présentés aux étudiants de façon simple c’est-à-dire en leur posant un problème à résoudre. Ces exercices peuvent également être présentés sous forme de protocole expérimental que les étudiants doivent suivre. Dans cette deuxième forme, les enseignants demanderont aux étudiants les explications sur phénomènes observés. Finalement un rapport écrit devra être demandé.
1° Déterminer la puissance de la substance inconnue.
2° Déterminer les effets sur la stimulation tétanique de bloqueurs dépolarisants et non dépolarisants (compétitifs).
3° Caractériser les effets du blocage provoqué par le dantrolène.
4° Déterminer les effets des agents anticholinestérasiques sur les réponses produites par les bloqueurs dépolarisants et non dépolarisants (compétitifs).
5° Comparer les effets de la tubocurarine, du suxaméthonium et de la triethylcholine sur les réponses à des stimulations de fréquences différentes (0,05 et 0,5 Hz). Expliquer les différences obtenues.
6° Déterminer la puissance relative de l’édrophonium et de la néostigmine.                             
7° Comparer les puissances de l’atracurium et de tubocurarine
Tableau 1 : Concentrations des substances produisant des effets, francs mais submaximaux sur la préparation du nerf phrénique/diaphragme (stimulation 0,05Hz, pas de traitement préalable).
Les différentes préparations générées par l’ordinateur peuvent avoir des sensibilités différentes. 

Substances (Sel)	Concentration (μM dans le bain)	
Iodure de triéthylcholine	1000	
Chlorure de choline	5000	
Hydrochlorure de 4-aminopyridine	1000	
Chlorure de tubocurarine	2	
Bromure de pancuronium 	0,2	
Triéthiodure de gallamine	18	
Bromure de fazadinium	1	
Besylate d’atracurium	1	
Dantrolène sodique	1	
Bromure d’hexaméthonium	5	
Sulfate de streptomycine	600	
Salicylate de physostigmine	.5	
Bromure de néostigmine	1	
Chlorure d’édrophonium	3	
Bromure de suxaméthonium	3	
Chlorure de carbachol	4000	
Bromure d’ acétylcholine	3000	
Sulfate d’atropine	> 1000	
Iodure de décamethonium	10	
Hydrochlorure de lignocaine	300	

Planification expérimentale
Un bon protocole expérimental, qui produit des résultats utilisables, se caractérise par :
1° production d’une réponse simple et non équivoque à la question posée
2° diminution du temps, du coût et des efforts mis en oeuvre.
3° simplification de l’analyse quantitative des données.
4° dans le monde réel : diminution du nombre d’animaux utilisés.
Les expériences qui suivent un protocole non optimal ne suivent pas ces quatre règles. Compte tenu de la grande variété des expériences dans un domaine tel que la pharmacologie, il n’existe pas de règle simple qui assurera que l’expérimentation suit un protocole approprié. Dans la majorité des cas, les pharmacologues acquièrent les éléments du protocole expérimental par l’expérience : c’est-à-dire en faisant des expériences et en réalisant après la fin de ces expériences qu’il existait un meilleur protocole pour répondre à la question posée.
Le texte qui suit propose quelques idées qui permettraient d’établir un protocole expérimental exempt des problèmes habituels.
Chaque expérience doit faire l’objet d’une question à laquelle il est possible de répondre expérimentalement. “ Quelles sont les propriétés de la substance ? ”, n’est pas une question car trop large. Cette question doit être subdivisée en une série de questions simples et à laquelle on répondra par plusieurs expériences. L’objectif final serait peut-être de définir les propriétés pharmacologiques de la substance “ x ”, mais pour le faire il est nécessaire d’employer la méthode scientifique, c’est-à-dire établir une hypothèse, de planifier une expérience pour tester cette hypothèse afin d’obtenir un résultat non ambigu qui confirme ou infirme cette hypothèse. Dans le dernier cas (élimination d’ une possibilité), une deuxième hypothèse peut être testée. Par exemple, après avoir examiné la structure ou les effets de la substance “ x ”, on peut émettre l’hypothèse que cette substance est une agoniste d’un type de récepteur donné. Dans ce cas, on utilisera une préparation appropriée pour la détection de ce type d’activité, on y rajoutera la substance “ x ” et on examinera la réponse produite. Si vous n’obtenez pas d’effet, votre hypothèse n’est pas infirmée. Il est possible que la concentration de la substance “ x ” soit trop faible (essayer avec d’autres concentrations). Il est possible que la préparation ne réponde pas parce qu’elle est “ morte ”. Dans ce cas il faut évaluer la réponse à d’autres agonistes connus. Si la substance “ x ” produit la réponse attendue, votre hypothèse n’est pas confirmée. Il est possible que la substance “ x ” réagisse sur un deuxième type de récepteurs dont la stimulation produirait le même effet. Dans ce cas, il faut utiliser des bloqueurs appropriés du deuxième récepteur. Même si les réponses sur ce deuxième récepteur sont antagonisées par le bloqueur approprié, l’hypothèse n’est toujours pas confirmée. Il est possible que la substance “ x ” n’agisse pas directement sur le récepteur mais par libération d’un transmetteur de sa réserve de stockage.                                                  
De nombreux points sont soulevés dans le paragraphe précédent, tels que :
- l’utilisation de concentrations ou de doses appropriées.
- l’utilisation de substances de référence pour s’assurer que la préparation répond de façon attendue.
Les expériences témoins sont partie intégrante de tout bon protocole expérimental.
- la considération de toutes les explications possibles du résultat obtenu. Les résultats compatibles avec l’hypothèse ne sont  pas une preuve absolue de l’hypothèse. Avec les expériences produisant des données quantitatives, le traitement mathématique des données doit être établi avant le commencement de l’expérimentation. Il est souvent utile de créer des données fictives et d’effectuer les analyses statistiques et numériques dans le but d’évaluer les possibles implications sur le choix de votre protocole expérimental. La planification des expériences pour la détermination de la puissance relative d’agoniste ou d’antagoniste nécessite une administration équilibrée et une randomisation des concentrations. Les tests statistiques même les plus simples, par exemple le test-t, sont basés sur l’hypothèse que chaque observation expérimentale est indépendante des autres.
Quelques points à retenir 
1. Une même substance peut ne pas donner des réponses similaires à des applications successives à la même concentration. Il est important d’établir ce point tôt dans votre expérimentation.
2. L’action de substances (surtout les antagonistes) peut être difficilement annulable. Le remplacement de la solution du bain même de nombreuses fois peut ne pas mener à l’annulation de l’effet d’une substance. De même avec des expériences in vivo , il est possible qu’une fois l’antagoniste administré, cette substance soit présente pendant toute la durée de l’expérimentation. Il est impératif de réfléchir aux expériences témoins nécessaires avant d’injecter un antagoniste. Il est possible qu’après l’administration de l’antagoniste, des réponses témoins appropriées soient impossibles à obtenir.
3. En règle générale il faut supposer qu’une substance n’est pas spécifique d’un seul récepteur. La spécificité est un phénomène quantitatif. Il est essentiel d’établir, avec des expériences témoins avant l’administration, que la concentration ou dose utilisée provoque l’effet attendu sans effets secondaires.
4. La viabilité de chaque préparation diminue avec le temps. Ceci explique qu’il est parfois difficile d’obtenir des réponses identiques à des applications répétées de concentrations identiques. Une nouvelle préparation aura en toute probabilité une sensibilité différente surtout en ce qui concerne les agonistes.
5. Pour l’établissement des courbes, concentration-réponse, il est souhaitable d’utiliser des concentrations qui augmentent par un multiple de 2 ou de 3, par exemple 1,2,4,8,16 ou 1,3,9,27. L’utilisation de tels intervalles mènera à un espacement égal des points pour une représentation logarithmique d’une courbe concentration-réponse. Ainsi les points seront distribués de façon homogène sur toute la gamme de concentration (dose) utilisée. Si une séquence de 1,2,3,4,5,6,7 est utilisée, ceci provoquera un resserrement des points. L’utilisation d’une telle séquence est un mauvais exemple de protocole expérimental. Cependant il faut se souvenir que dans certains cas des courbes concentration (ou dose)-réponse peuvent être très pointues.
6. Il ne faut pas oublier que la précision nécessaire est relative. Si vous avez besoin d’une indication approximative de la spécificité d’un agoniste, la détermination de la puissance relative avec une précision de 1% ne sera pas nécessaire.
7. L’utilisation de standards appropriés est très importante. La détermination d’une puissance relative nécessite l’utilisation d’une autre substance qui agit au niveau du même type de récepteur. Si les courbes de concentration-dose/réponse ne sont pas parallèles, la puissance relative varie avec l’amplitude de la réponse.
8. Il ne faut pas oublier que in vivo les substances agissent à différents niveaux ainsi l’acétylcholine ne modifiera pas seulement la transmission neuromusculaire mais également la fonction cardiaque.
Si vous vous servez d’un protocole détaillé avec une suite d’opérations prédéterminées, il peut être nécessaire de déterminer les concentrations des substances à utiliser. On peut également vous demander de produire le protocole expérimental adapté à une question donnée. Il est essentiel dans ce dernier cas que le protocole réponde directement à des questions simples et non ambiguës.
Ecran d’introduction
Préparation in vitro du nerf phrénique-diaphragme du rat
Votre préparation est prête, elle est dans une solution à 37°C oxygénée avec 95% oxygène et 5% CO2. Des changements de tension musculaire sont enregistrés de façon isométrique à une tension passive de 0,2g.
Des pulsations rectilignes supramaximales (8v, 0,2msec) à 0,05, 0,5 ou 30 Hz peuvent être appliquées sur le nerf phrénique via une électrode en forme de crochet. Les concentrations des substances sont des concentrations dans le bain d’organe. L’opération “ Washout bath ” remplace le liquide dans la cuve par une solution de Kreb’s sans substance(s).
Il est possible que plusieurs “ Washout bath” soient nécessaires pour enlever totalement la substance et annuler ses effets.
Il faut noter que les valeurs qui s’affichent après chaque administration représente le temps (en minutes) depuis le début de l’expérimentation. Il est possible que du temps supplémentaire soit pris par le programme de façon automatique afin d’attendre une réponse stabilisée. Le bouton “ Continue experiment ” permet de revoir l’écran et continuer l’expérience (sans ajouter de substance). 
Deuxième écran
Les réponses provoquées doivent être évaluées en terme d’amplitude et d’évolution dans le temps. L’utilisation du bouton “ Click to pause experiment or to review  record ” vous permet de revoir votre enregistrement. Cette manœuvre vous permet également d’arrêter votre expérience pendant que vous réfléchissez à sa suite éventuelle.
Il ne faut pas oublier qu’il est impossible d’arrêter une expérience réelle. Vous pouvez imprimer une partie de votre enregistrement en utilisant le bouton “ Print screen ”. Vous devez utiliser une imprimante reliée à l’ordinateur et il est fortement déconseillé d’utiliser une imprimante en réseau. L’utilisation d’une imprimante en réseau peut provoquer une attente dans votre réseau de plusieurs heures.

Vos commentaires à :

Atkinson@pharma.uhp-nancy.fr